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Progetto ATM sostenuto nel 2010

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Ultimo aggiornamento (Giovedì 20 Gennaio 2011 19:22)
Scritto da Administrator Mercoledì 19 Gennaio 2011 20:44

 
Torino, 31.12.2010

Associazione “Noi per Lorenzo”

Gentile Associazione,

Nel ringraziare tutti voi per il supporto che ci avete dato vi presentiamo la relazione finale del progetto che e’ stato da voi finanziato. 
Con l’occasione porgiamo i più sinceri auguri di Buon Anno e Felice 2011
Alfredo Brusco e Simona Cavalieri

I pazienti affetti da Atassia Telangiectasia presentano per la maggior parte mutazioni che causano perdita di funzione della proteina .
Attualmente l’analisi di mutazioni del gene viene svolta attraverso l’impiego combinato di diverse metodiche che comprendono l’analisi di quattro di marcatori microsatelliti fiancheggianti e interni al gene per lo studio degli aplotipi associati a mutazioni ricorrenti, l’analisi della porzione codificante (esoni 4-65) la proteina ATM mediante DHPLC e lo studio dei grossi riarrangiamenti genomici mediante la tecnica MLPA. L’utilizzo di tutte queste tecniche ci ha permesso di trovare il 95% delle mutazioni nella casistica di pazienti AT giunti fino ad oggi nel nostro laboratorio. Questa percentuale e al momento la piu’ alta registrata tra tutti i laboratori che in Italia si occupano della diagnostica dell’Atassia Telangiectasia. Inoltre questi risultati hanno portato alla stesura e pubblicazione di un articolo sulla rivista scientifica Annals of Human Genetics. (Cavalieri et al. 2008 Ann.Hum.Genetics, 72(Pt1).10-8).
La corretta diagnosi clinica della malattia e la ricerca di mutazioni nel gene ATM, risulta inoltre di particolare importanza in quanto esistono altre patologie neurodegenerative quali le aprassie oculomotorie AOA1 e AOA2 che, per alcuni segni clinici e biochimici potrebbero essere confuse con questa malattia. 
Esiste tuttavia una piccola percentuale di pazienti AT, stimata attorno al 4%, in cui una o entrambe le mutazioni sono ignote. Alcune di queste mutazioni potrebbero essere localizzate in regioni regolatorie per l’espressione del gene ATM o la stabilizzazione dell’RNA messaggero.
Lo sviluppo, negli ultimi anni, di nuove tecniche di sequenziamento del DNA sempre piu’ veloci ed efficienti ha permesso di rivoluzionare le modalita’ di ricerca di varianti anche rare, diminuendo notevolmente i costi.
Ci siamo per questo proposti di applicare una delle tecniche di sequenziamento ad alta fedelta’ recentemente sviluppate allo studio di tutta la porzione genomica di ATM ovvero le regioni 5’ e 3’UTR a monte e a valle del gene e tutta la porzione codificante per un totale di 185Kb.
La fattibilita’, i costi e la sensibilita’ di tale tecnica sono stati inizialmente verificati analizzando un paziente AT appartenente alla nostra casistica in cui, tramite l’applicazione delle metodiche di analisi in  nostro possesso, una sola delle due mutazioni era stata trovata.
Per effettuare il sequenziamento completo l’intera regione genomica e’ stata suddivisa in 36 frammenti parzialmente sovrapposti di lunghezza variabile di 4-7 Kb. I frammenti sono stati amplificati e quantificati mediante il fluorimetro. Un totale di 40ug di amplificato genomico contenente quantita’ equimolari di ogni frammento e’ stato successivamente purificato e spedito alla ditta BMR Genomics che ha svolto il lavoro di sequenziamento, attraverso l’impiego del sequenziatore ROCHE 454 GENOME SEQUENCER FLX. 
Questo sequenziatore sfrutta un nuovo concetto di sequenziamento, totalmente diverso rispetto alla classica tecnologia Sanger, a cui si affianca offrendo nuove prospettive di ricerca. Il 454 si basa sulla tecnologia del pirosequenziamento e permette di ottenere un elevato numero di sequenze di qualità elevatissima (>99,5% di accuratezza) con un'unica corsa. Inoltre la nuova tecnica dell'emPCR (emulsion-pcr) riduce drasticamente i tempi totali del processo, eliminando la necessità di clonare il DNA da sequenziare. Il prodotto dell'emPCR viene caricato su una particolare piastra di sequenziamento chiamata PTP (PicoTiterPlate) che permette di effettuare fino a 1,200,000 reazioni di pirosequenziamento contemporaneamente.
Il coverage medio atteso e’ di circa 30X, ovvero ogni singolo frammento in cui la regione genomica viene suddivisa per il sequenziamento dovrebbe essere sequenziato in media 30 volte. 
I risultati ottenuti dal sequenziamento sono stati elaborati confrontando i dati grezzi con la sequenza di riferimento del gene ATM, riportata nella banca dati GeneBank, mediante l’utilizzo del software NextGene della Softgenetics. 
Il lavoro e’ stato inoltre presentato come poster al meeting internazionale AT che si e’ svolto a Los Angeles dall’11 al 14 aprile 2010.
In breve, l’analisi dei dati ha dimostrato che il tramite questa tecnica il 99,5% della regione e’ stata correttamente coperta dal sequenziamento. Purtroppo pero’ i risultati ottenuti non sono stati pari a quelli attesi e la seconda mutazione non e’ stata individuata. In primo luogo la copertura della regione genomica ha avuto un coverage medio di 20X (quindi decisamente piu’ basso di quello medio atteso) e in alcune regioni anche minore del 5X. Questo ha fatto si che alcuni polimorfismi noti, gia’ trovati nel paziente mediante DHPLC, siano stati persi, cosi’ come la mutazione nota (uno stop codon nell’esone 45) che e’ stata sequenziata con un coverage di 7X e che quindi, se non fosse gia’ stata identificata, sarebbe stata persa. Per contro, in alcune tratti della sequenza, soprattutto in regioni ripetute e molto ricche di poliA e poliT, la tecnica del pirosequenziamento puo’ introdurre piccole delezioni e inserzioni di singole basi che risultano pero’ false varianti. Un’altra fonte di errore puo’ essere stata introdotta nella quantificazione non perfettamente equimolare dei frammenti amplificati, per cui si possono verificare degli sbilanciamenti  che portano alcune regioni ad essere maggiormente coperte dal sequenziamento e alcune meno.
In conclusione questi risultati ci hanno portato a progettare un nuovo sequenziamento della regione genomica di ATM che verra’  prevedera’ l’impiego di un nuovo sistema di sequenziamento, l’Illumina GAIIx, piu’ sensibile e affidabile del Roche 454.